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本试剂盒提供了多肽电泳全套试剂，可以用来检测1～20kD的多肽大小。本试剂盒可配制至少10块常规大小（8×10cm），厚度1mm的PAGE胶。

• 分辨率高：凝胶缓冲液独特配方，可以有效分离1～5kD多肽。
  
• 使用方便：制胶无需计算所需溶液量；无需制备三层凝胶（浓缩胶，夹层胶，分离胶）。
  
• 配套Tris-Tricine-SDS缓冲液，无需区分阳极缓冲液和阴极缓冲液。
  
• 试剂盒配套有预染蛋白Marker，方便检测多肽大小。
  
• 试剂盒配套有快速蛋白染色液，最快可以在30分钟内完成染色过程，有效避免小肽从凝胶中游离。

• 制胶
  
  • 配制分离胶：
    
    • 按照表一将不同体积的成分加入到小烧杯中混合；立即混匀5～10秒，以使溶液充分混匀。
      表1：（一块厚度1mm 8×10cm凝胶胶用量）^*
      

      成分	分离胶	浓缩胶
      	18％T5C/5mL	4％T 2.6C/1.5mL
      2×凝胶缓冲液	2.5mL	0.75mL
      2×PAA浓缩胶聚合溶液	/	0.75mL
      2×PAA分离胶聚合溶液	2.5mL	/
      10%APS	~50μL	~15μL
      TEMED	~5μL	~1.5μL

      • 如非必须，不要使用厚度1.5mm的凝胶，尽量使用厚度1mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
    • 在玻璃板中迅速灌入适量分离胶溶液，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5cm即可。注：此溶液为过量，请勿全部注入。
      
    • 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2cm的无水乙醇层，使凝胶表面保持平整。
      
    • 静置10～30分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表1的标准条件调节促凝剂的加入量。分离胶在25℃条件下，约20分钟可以聚合。
  • 配制浓缩胶：
    去除覆盖在分离胶上的乙醇层，用滤纸将残留的乙醇吸去。
    
    • 按照表一将不同成分加入到小烧杯中混合；立即混匀5～10秒，以使溶液充分混匀。
      
    • 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
      
    • 静置30～50分钟待凝胶聚合。
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表1的标准条件调节促凝剂的加入量。浓缩胶在25℃条件下，约40分钟可以聚合。
• 电泳
  
  • 变性电泳缓冲液和样品配制：
    
    • 10×Tris-Tricine- SDS缓冲液配制：将10×Tris-Tricine-SDS缓冲液（10×TTS）粉末（货号：RFT061）置于一干净的烧杯中，加入500mL超纯水，彻底搅拌混匀，不要调节pH，即配成500mL 10×缓冲液。超纯水稀释10倍配成1×Tris-Tricine-SDS缓冲液。
      
    • 变性样品处理：待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液（变性，还原，含溴酚蓝，货号：RFT487）等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，根据说明书上样（预染Marker不能加热处理，非预染Marker上样前一般要95℃处理5分钟）。试剂盒配套的预染Marker（货号：RFT488）不要加热处理，溶化混匀后直接上样，1mm厚度10齿梳子建议上样3～5μL。
  • 电泳：
    将电泳槽的内槽加满电泳缓冲液，轻柔拔出梳子，用1mL移液器将梳孔吹洗干净，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（表2），至溴酚蓝指示前沿至分离胶下沿位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要2.5～3个小时。
    表2：多肽电泳条件（单板电泳）
    

    	电压	电流变化	电泳时间
    浓缩胶	恒压80V	起始电流：30～35mA终止电流：25～30mA	~20min
    注：等待样品指示前沿到达分离胶上沿时，调高电压
    分离胶	恒压120V	起始电流：40～45mA终止电流：15～20mA	~200min
    注：恒压条件下，电流不可调节，电流是逐渐降低的，观察记录电流数值。

• 染色
  
  • 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。
    
  • 弃蒸馏水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适)，摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。
    

    待检测蛋白量	染色时间
    ＞1μg	~5分钟
    100ng～1μg	~10分钟
    10ng～100ng	~60分钟

  • 摇床上摇动至所有条带清晰可见。
    
  • 蒸馏水摇动漂洗脱色1～2次，每次5～10分钟，至凝胶背景干净。
    
  • 收集用过的染色液，可以重复使用2～3次。
    凝胶也可以使用常规考马斯亮蓝染色液和脱色液进行染色和观察。需要注意的是，常规染色和脱色方法需要较长时间，小肽由于长度较短，和凝胶结合不紧密，长时间在溶液中浸泡容易从凝胶中脱离。QuickLan蛋白染色液除具有染色快，无毒，灵敏性高等特点外，还能对小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。
• 转膜
  多肽转膜选择孔径0.22μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22μm NC膜。
  
  • 半干转：使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030）。转膜推荐条件：一板小型凝胶（8×10cm）恒流，1.3 A，7～10min。
    
  • 湿转：湿转转膜缓冲液（25mM Tris,192mM Glycine,0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液(湿转，货号：RFT391）。转膜条件：恒流200 mA 40～60min。